RNA甲基化修飾（m6A）研究RNA甲基化修飾約占所有RNA修飾的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）是高等生物mRNA和lncRNAs上為普遍的修飾。目前發(fā)現(xiàn)microRNA，circRNA,rRNA,tRNA和snoRNA上都有發(fā)生m6A修飾。m6A修飾主要發(fā)生在RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能由“編碼器(Writer)”、“消碼器(Eraser)”和“讀碼器(Reader)”決定[1]。“編碼器(Writer)”即甲基轉(zhuǎn)移酶，目前已知這個(gè)復(fù)合物的成分有METTL3，METTL14,WTAP和KIAA1429；而ALKBH5和FTO作為去甲基酶（消碼器）可逆轉(zhuǎn)甲基化；m6A由m6A結(jié)合蛋白識(shí)別，目前發(fā)現(xiàn)m6A結(jié)合蛋白（讀碼器）有YTH結(jié)構(gòu)域蛋白（包括YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3，YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和HNRNPC）。m6A酶系統(tǒng)METTL3是早先被鑒定為結(jié)合SAM的組件，其缺失引起小鼠胚胎干細(xì)胞、Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中m6Apeaks的減少。METTL3及其同源蛋白METTL14定位在富含剪切因子的細(xì)胞核內(nèi)亞細(xì)胞器－核小斑（Nuclearspeckle）上，顯示ｍ６Ａ修飾可能和ＲＮＡ的剪切加工相關(guān)。WTAP與METTL3–METTL14二聚體相互作用，并共定位于核小斑，影響甲基化效率，參與mRNA剪。而KIAA1429作為候選的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的新亞基。上海研錄生物醫(yī)藥為您提供一站式科研技術(shù)服務(wù)。江蘇病理科研技術(shù)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室

注意事項(xiàng)1.病毒包裝的幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)主要包括：細(xì)胞因素、載體系統(tǒng)(盡量使用成熟的商業(yè)化載體系統(tǒng))、構(gòu)建重組的質(zhì)粒正確與否、質(zhì)粒抽提純化情況、包裝轉(zhuǎn)染控制(24、48小時(shí)的細(xì)胞及熒光狀態(tài)判斷)、目的基因?qū)Σ《景b影響(基因大小、序列情況、蛋白功能毒性等都會(huì)影響到是否能包裝成功)。，需要觀察包裝病毒后的48h培養(yǎng)基顏色是否橙紅。3.病毒濃縮：病毒一般在48h和72h各收一次。如果不想濃縮病毒的話，也可以直接將收集的病毒上清作為要的細(xì)胞的培養(yǎng)基，但是可能效果會(huì)不太好。并且一般收病毒時(shí)，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)已經(jīng)損耗了很多，那樣直接培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)損害細(xì)胞，所以建議還是進(jìn)行濃縮后再。常見(jiàn)問(wèn)題1.包裝病毒時(shí)293T細(xì)胞狀態(tài)不好，或者鋪得過(guò)密，可以選擇放棄該次實(shí)驗(yàn)。2.目的載體過(guò)大，不易。3.避免轉(zhuǎn)染過(guò)程以及后續(xù)過(guò)程出現(xiàn)的污染。海南組織科研技術(shù)服務(wù)技術(shù)EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)是一種新型的細(xì)胞增殖檢測(cè)方法。

制作該模型的方法為大鼠腹腔麻醉消毒后選取腹部正中切口打開(kāi)腹腔長(zhǎng)約2cm，尋找盲腸，小心分離其遠(yuǎn)端與大腸的系膜，在盲腸遠(yuǎn)端1/2處用無(wú)菌4號(hào)絲線緊緊結(jié)扎，并用無(wú)菌7號(hào)針頭在已結(jié)扎盲腸遠(yuǎn)端處貫通穿刺，然后把盲腸推回腹腔，關(guān)閉腹腔。影響因素多數(shù)研究一致認(rèn)為盲腸結(jié)扎位置是CLP模型中死亡率和疾病嚴(yán)重程度的主要決定因素。結(jié)論為：①結(jié)扎25%或以下的盲腸死亡率幾乎為零，為輕度膿毒癥；②結(jié)扎50%～60%的盲腸導(dǎo)致術(shù)后死亡率為60%，為中度膿毒癥；③結(jié)扎75%或以上的盲腸導(dǎo)致小鼠在術(shù)后2～3d內(nèi)全部死亡，為重度膿毒癥。而在不同程度膿毒癥中，死亡主要集中在初的48h內(nèi)。有研究通過(guò)改變盲腸結(jié)扎位置和穿刺針直徑來(lái)調(diào)節(jié)膿毒癥的嚴(yán)重程度，其中提到與結(jié)扎長(zhǎng)度小于1cm的小鼠相比，結(jié)扎長(zhǎng)度超過(guò)1cm的小鼠死亡率增加至100%；增加穿刺針的直徑也使得存活率從100%（22G針）降低至55%（19G針）。結(jié)論為：在上述兩個(gè)因素中，盲腸結(jié)扎位置比針頭大小影響更為。CLP誘導(dǎo)的膿毒癥術(shù)后6h即可出現(xiàn)菌血癥，術(shù)后約12h出現(xiàn)膿毒癥相關(guān)臨床癥狀，包括發(fā)熱、寒戰(zhàn)、毛發(fā)豎立、全身無(wú)力和活動(dòng)減少等，術(shù)后18h開(kāi)始死亡。總之，在制作CLP模型時(shí)。

實(shí)驗(yàn)樣本分類實(shí)驗(yàn)一般采取樣本有：血液樣本、樣本和細(xì)胞樣本。通常，樣本采集后，應(yīng)立即用等滲溶液（PBS或生理鹽水）盡量把血液漂洗干凈（除非血液也是分析對(duì)象），用濾紙或紗布吸干，把樣本分切成幾分，每份的體積約2個(gè)黃豆大小，每份用一個(gè)管子裝。血液樣本的采集應(yīng)根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)的要求，將會(huì)采取不同策略。血清樣本：全血中不加抗凝劑，血液凝固后取出的不含凝血因子的淡黃色透明液體。（全血標(biāo)本室溫放置2小時(shí)3000rpm/min離心15min）血漿樣本：全血中加抗凝劑，血液凝固后取出的含凝血因子的淡黃色透明液體。（可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8℃，3000rpm/min離心15min）如果是做生化\ELISA等檢測(cè)可以考慮血漿和血清，根據(jù)獲得的樣本量可考慮分裝成100-500μl/管，可避免反復(fù)凍融造成的檢測(cè)誤差。生化：建議優(yōu)先選擇血清，其次選擇肝素抗凝血漿；ELISA：建議優(yōu)先選擇血清，其次選擇肝素或EDTA抗凝血漿；凝血實(shí)驗(yàn)：只能選擇枸櫞酸鈉抗凝血漿；血常規(guī)：只能選擇EDTA抗凝全血；如果要收集其中的白細(xì)胞、血小板等建議用抗凝全血。如果要做流式建議用專門的流式用血液收集管，防止表面抗原的丟失，或者盡快安排就近檢測(cè)。樣本處理取樣完后。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)這些取樣細(xì)節(jié)，你有注意嗎？

一種是用beta巰基乙醇打開(kāi)蛋白質(zhì)分子二硫鍵的，另一種是用DTT(二硫蘇糖醇)。兩者的作用是一樣的，但特點(diǎn)不一樣，前者更容易與氧氣反應(yīng)，穩(wěn)定性比后者差，如果在常溫下暴露在空中，前者只能維持24小時(shí)的活性，后者卻可以維持7天左右。所以該如何選擇?如果是蛋白樣品較少，跑幾次就可以用完的樣品，這時(shí)選擇beta巰基乙醇。如果樣品很多，計(jì)劃跑上幾十次的，優(yōu)先選擇DTT,建議變性后分裝保存。二、SDS-PAGE凝膠配制1、配膠前準(zhǔn)備首先強(qiáng)調(diào)一下，一塊好的膠是跑好蛋白的前提，所以這個(gè)環(huán)節(jié)也不容忽視。玻璃板的選擇，一種是1毫米厚度的，另一種是，這個(gè)厚度選擇也是有講究的，如果上樣體積小于10微升，優(yōu)先選1毫米，否則選。原因是什么?答案在轉(zhuǎn)膜部分揭曉。還有分離膠的濃度也要選擇適合的。然后玻璃板和梳子要洗干凈，晾干。裝板，注意厚板和薄板的底部要對(duì)齊，否則會(huì)漏膠。加制膠的各成分前，要觀察液體是否有沉淀，有沉淀的盡量不要用。2、制膠按配方說(shuō)明依次加入各組分，加完SDS后先簡(jiǎn)單手動(dòng)搖勻幾下，然后迅速加入過(guò)硫酸銨和TEMED,搖勻，緊接著就灌膠。然后我習(xí)慣用95%的酒精壓膠，我也用過(guò)純水，感覺(jué)純水壓沒(méi)那么好，由于水的密度較大，會(huì)把分界處的膠壓得膨大。飼養(yǎng)動(dòng)物及干預(yù) 動(dòng)物購(gòu)買后需要將時(shí)間節(jié)點(diǎn)提前規(guī)劃好。上海疾病科研技術(shù)服務(wù)培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)干貨 | 分子克隆實(shí)驗(yàn)——無(wú)縫克隆。江蘇病理科研技術(shù)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室

圖2MAZTER-Seq實(shí)驗(yàn)流程圖圖3MAZTER-MINE分析m6A示意圖接下來(lái)作者便是要驗(yàn)證這一新方法的可行性了。在酵母中敲除IME4的情況下，檢測(cè)到的剪切效率高于野生型（剪切效率高低m6A水平），m6A抗體富集后的樣品剪切效率也低于未富集的Input組。整體水平可靠，那檢測(cè)的特異性位點(diǎn)是否準(zhǔn)確呢？作者也將該方法檢測(cè)到的新甲基化位點(diǎn)使用放射標(biāo)記層析檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的位點(diǎn)準(zhǔn)確存在而且與剪切效率相符合。如圖5所示。而圖6中，作者則是與m6A抗體IP的方法進(jìn)行了比較，也證實(shí)了這一方法的可行性。圖5MAZTER-Seq檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證圖6MAZTER-Seq與m6A-Seq比較分析此外，后文中作者也在大規(guī)模的CRISPR-Cas9改變m6A狀態(tài)和酵母減數(shù)分裂模型中檢測(cè)了MAZTER-Seq這一系統(tǒng)；并進(jìn)一步通過(guò)這一方法檢測(cè)了哺乳動(dòng)物不同細(xì)胞間m6A水平的保守性；也探究了去甲基化酶FTO對(duì)整體m6A甲基化水平的影響等。這里小編主要給大家分享這一新技術(shù)，其他部分暫不過(guò)多分析了。新的技術(shù)能拓展我們的研究?jī)?nèi)容；對(duì)于這一技術(shù)。江蘇病理科研技術(shù)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室