讀數(shù)前可在搖床上溫柔混勻，酶標(biāo)儀在 450nm 波長處檢測每孔的吸光度。

***率（％）= [（對照孔吸光度-實(shí)驗(yàn)孔吸光度）/（對照孔吸光度-空白孔吸光度）]×100=IC50

注意事項(xiàng)

CCK8法檢測細(xì)胞生長情況基于的原理是脫氫酶催化的反應(yīng)，如果實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件中存在還原劑的影響，應(yīng)事先去除。如果實(shí)驗(yàn)條件中存在還原物質(zhì)，需單獨(dú)測定還原物質(zhì)的空白吸光度。如果還原物質(zhì)的吸光度很小，可以忽略不計(jì)；但如果吸光度很大，則需要去除培養(yǎng)基，再用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，然后再加入新的 100ul培養(yǎng)基和10ul CCK-8 溶液進(jìn)行檢測。 水溶性，不需要換液，尤其適合于懸浮細(xì)胞.北京cck8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)過程

當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時，貼壁細(xì)胞的**小接種量至少為1000 個/孔(100μl培養(yǎng)基)。檢測白細(xì)胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2500 個/孔(100μl培養(yǎng)基)。酚紅和血清對CCK8法的檢測不會造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

注意事項(xiàng)CCK8可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細(xì)胞。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每次測定的過程中需要避免細(xì)菌污染，以免影響結(jié)果。CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，培養(yǎng)板**外一圈的孔**容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，**外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。在培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。 北京cck8英文說明書代謝率低了以后，細(xì)胞呼吸減弱，NAD+產(chǎn)生減少，測出的Formazan也會減少。

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)就是對細(xì)胞生長的測定，常用的方法有MTT、CCK8以及流式檢測。閱讀大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，如果想證明一個***或者說是一個作用條件對細(xì)胞生長的影響，基本上大家都采用MTT或CCK8結(jié)合流式的雙標(biāo)準(zhǔn)來證明作用效果。所以，***先給大家介紹一下MTT和CCK8比色法的實(shí)驗(yàn)操作和注意事項(xiàng)。

MTT實(shí)驗(yàn)操作

1、在96孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，設(shè)置對照組（細(xì)胞+無血清培養(yǎng)基）、實(shí)驗(yàn)組和空白組（無血清培養(yǎng)基），可以采用如下圖的排版方式：

2、在對照組和實(shí)驗(yàn)組中，每孔加入細(xì)胞懸液100ul,培養(yǎng)24小時；

貼壁生長的時間我一般就直接讓它貼壁長24h了，這個時間細(xì)胞已經(jīng)貼壁完全，而且這樣設(shè)置時間對自己安排實(shí)驗(yàn)時間也方便。沒人愿意大半夜爬起來做實(shí)驗(yàn)吧。3、加藥后的孵育時間，我的實(shí)驗(yàn)摸了3個時間，24h，48h，72h。然后根據(jù)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性（RSD）、OD值的范圍（1.0左右）這些來選擇比較好的時間。太長了就沒有必要了，細(xì)胞呆在孔里幾天不換液結(jié)果可想而知了。4、CCK8試劑加入量，說明書中明確寫出建議加入量為培養(yǎng)基體積的10%。這里有一個問題：假設(shè)我要孔內(nèi)是200微升的體系，即細(xì)胞懸液+藥液+CCK8=200微升呢，還是細(xì)胞懸液+藥液=200微升，cck8不算在體系內(nèi)呢。關(guān)于這一點(diǎn)文獻(xiàn)報道不一致。本人**終采用的是后者。5、cck8試劑加入后孵育時間，隨著時間的增加，OD值就會增大。總之原則就是把OD值控制在1.0左右。這里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。在CCK-8試劑盒中，**主要的化學(xué)藥品是WST-8.

CCK-8的原理

所以粗略的可以認(rèn)為生成的甲瓚物的顏色的深淺與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。為什么是粗略的呢，因?yàn)檫@里沒有考慮到細(xì)胞代謝水平的高低，有些細(xì)胞在***處理后，可能活細(xì)胞數(shù)不變，但是代謝率低了以后，細(xì)胞呼吸減弱，NAD+產(chǎn)生減少，測出的Formazan也會減少，所以此時怎么算呢（此時我就比較懷戀中性紅了）？當(dāng)然也有解決的辦法，下期給大家介紹。因此可利用這個原理進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析，在吸光度為450時檢測讀數(shù)。顏色也會越深 請問合適的種板數(shù)是怎么定義的呢?北京cck8吸光度范圍

CCK-8試劑中含有WST–8.北京cck8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)過程

實(shí)驗(yàn)材料及試劑

96 孔板、CO2培養(yǎng)箱、酒精燈、移液***、酶標(biāo)儀等；細(xì)胞、CCK8等。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，每孔按 4×103個接種至 96 孔板中，每組設(shè)置8個復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒后。繼續(xù)培養(yǎng) 48h 后，棄含藥培養(yǎng)基，每孔加入新鮮配制的含 10ｕL的毒性檢測液CCK8，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4h 后，用酶標(biāo)儀測波長為450 nm的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次， 取實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值作為**終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。按公式計(jì)算生長***率＝[(對照組 OD－實(shí)驗(yàn)組 OD)/對照組 OD]  ×**，以分組為橫坐標(biāo)，生長***率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長***率柱狀圖。 北京cck8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)過程