核酸純化只測(cè)OD值之驚天秘密內(nèi)幕

來(lái)源：發(fā)布時(shí)間：2024-02-29

核酸純化只測(cè)OD值之驚天秘密內(nèi)幕

機(jī)器真的可以直接測(cè)量核酸的真實(shí)純度和濃度嗎？
我們這個(gè)行業(yè)內(nèi)的誤解是：機(jī)器可以測(cè)量核酸的純度和濃度，就不用跑電泳了。
有些廠家為了推銷(xiāo)分光光度計(jì)機(jī)器推廣了這個(gè)不太真實(shí)的概念。

讓我們一起來(lái)看看這個(gè)質(zhì)粒提取后-瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)的對(duì)比
從結(jié)果分析：從抽提的質(zhì)粒濃度上來(lái)看，T公司試劑盒提取的質(zhì)粒濃度要普遍高于Aidlab的試劑盒。但在質(zhì)粒跑膠的亮度對(duì)比上，兩者抽提的質(zhì)粒跑膠亮度沒(méi)有較大差距。
所以T公司試劑盒提取的結(jié)果檢測(cè)的OD值實(shí)為虛高。

真實(shí)情況是分光光度計(jì)包括Nanodrop是無(wú)法通過(guò)測(cè)量OD比值來(lái)判斷核酸的純度的，od260:280比值判斷的只是蛋白殘留的純度，od260:230比值判斷的只是鹽離子的純度，而核酸里面還有其它各種雜質(zhì)可能殘留，這些雜質(zhì)，機(jī)器是沒(méi)法測(cè)量出來(lái)的，但是雜質(zhì)也有吸光值OD，就會(huì)干擾機(jī)器的正確檢測(cè)核酸濃度。

機(jī)器測(cè)量的是樣品的總吸光值，然后換算成濃度,如果樣品是100%純的核酸，機(jī)器確實(shí)可以把所有的吸光值換算成濃度，這才是真實(shí)的濃度。但是如果樣品里面有雜質(zhì)呢？機(jī)器測(cè)量的總吸光值里面還含有雜質(zhì)的吸光值，但是機(jī)器無(wú)法區(qū)分，還是會(huì)把總吸光值換算成濃度，這個(gè)時(shí)候測(cè)量的濃度還包括了雜質(zhì)帶來(lái)的吸光值的濃度，Z后導(dǎo)致機(jī)器測(cè)量的濃度比真實(shí)核酸濃度高，OD值實(shí)際是虛高了。

如果使用這樣有雜質(zhì)的質(zhì)粒有什么后果呢？
1、質(zhì)粒濃度低
2、含有雜質(zhì)導(dǎo)致無(wú)法準(zhǔn)確定量，可能造成不準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
3、含有雜質(zhì)可能抑制下游的酶切和PCR等酶反應(yīng)，造成實(shí)驗(yàn)不準(zhǔn)。

DNA/RNA質(zhì)量評(píng)價(jià)的兩大方法
一、“跑電泳”是金標(biāo)準(zhǔn)!
跑電泳可以得到很多信息：是否降解，是否有DNA或者蛋白污染，是否有雜帶。
跑電泳可以通過(guò)DNA Marker估算濃度，更易把控后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)度！

二“測(cè)OD值”只是輔助手段
只有在RNA不降解，無(wú)污染的情況下。
測(cè)量的OD值才是真實(shí)的!