宿主細胞蛋白通常是與重要細胞功能相關(guān)的蛋白，如細胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成修飾、細胞存活、細胞凋亡等，在工藝過程中分泌或因細胞死亡或裂解而釋放。生產(chǎn)過程中，以下幾個因素會主要影響HCP的組成和豐度：①宿主細胞基因組調(diào)控及培養(yǎng)工藝：特定工藝下，潛在的HCP數(shù)量可能非常大，且非所有基因都表達，某些基因在不同的時間和條件下表達；如大腸桿菌約4300個基因，不同的工藝產(chǎn)物會經(jīng)歷獨特的翻譯后修飾，增加了HCP的總數(shù)和生化復雜性。有研究表明，如大腸桿菌表達的蛋白，其不同蛋白之間存在數(shù)量差異，這些差異可能是對環(huán)境條件的適應性反應，但大多數(shù) (85-90%) 有潛在免疫原性的宿主細胞蛋白在不同的發(fā)酵過程中都會出現(xiàn)。②產(chǎn)物表達方式：宿主細胞與外源基因、載體和輔助成分組成的體系可以穩(wěn)定、瞬時和誘導表達；如大腸桿菌常見的表達形式有胞內(nèi)表達、分泌表達、可溶性表達、不溶性的包涵體形式，以及融合和非融合表達。③純化步驟及產(chǎn)品本身的特性的影響：純化過程中大部分的HCP被去除(>99％)，殘留的HCP仍保留在產(chǎn)品中，可能與產(chǎn)品共結(jié)合，一起被純化。

針對宿主細胞蛋白殘留檢測，工藝特異型檢測試劑盒（upstream-process）專為特定生產(chǎn)工藝設(shè)計，其關(guān)鍵在于使用產(chǎn)物的實際宿主細胞進行開發(fā)與驗證，模擬真實生產(chǎn)流程獲取廣譜HCP抗原，并要求抗血清具備高度覆蓋率以適應工藝變動，確保對特定生產(chǎn)流程殘留的高度準確監(jiān)控。平臺型檢測試劑盒（platform）則由生產(chǎn)商針對其特定表達宿主細胞和相近工藝自行開發(fā)，其優(yōu)勢在于可使用相同的參考標準品和試劑統(tǒng)一監(jiān)測在該宿主上生產(chǎn)的不同產(chǎn)品，適用于上游工藝足夠相似的產(chǎn)品線。通用型檢測試劑盒（commercial）則作為市售廣譜方案，適用于相似宿主細胞的常規(guī)檢測，但因其制備過程可能無法完全模擬目標產(chǎn)物的實際生產(chǎn)，必須嚴格評估多克隆抗體對特定產(chǎn)品HCP的覆蓋率，以保證檢測可靠性。三類試劑盒覆蓋從深度定制到通用篩查的不同需求。

美國藥典<1132>章節(jié) 和歐洲藥典<2.6.34>章節(jié)建議對于即將進入商業(yè)化生產(chǎn)的（臨床III期及以后）或生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的生物制品采用定制化ELISA試劑盒進行宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測，原因可能是：①確保檢測方法可以充分覆蓋實際工藝產(chǎn)生的HCPs，避免漏檢關(guān)鍵雜質(zhì)；②支持更準確的免疫原性和安全性評估；③提供真實的工藝表征數(shù)據(jù)，而非推測數(shù)據(jù)；④滿足商業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)量控制的方法一致性。此外，對目前市場上常見的HCP ELISA商業(yè)化試劑盒進行了測試，并與HCP ELISA定制化試劑盒進行對比，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同商業(yè)化試劑盒檢測同一樣品的檢測值差異大，且準確性均低于定制化試劑盒，表明定制化試劑盒更能滿足產(chǎn)品質(zhì)量控制所需。

影響宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測結(jié)果的因素之一是操作規(guī)范。一方面，實驗人員的專業(yè)技能和經(jīng)驗對檢測結(jié)果的準確性有很大影響。熟練的實驗人員能夠準確地進行樣品處理、試劑配制和儀器操作，減少人為誤差。另一方面，一個合理的HCP檢測方法，在開發(fā)及應用時，應當考慮操作的合理變動區(qū)間（即耐用性）并設(shè)置相質(zhì)控，從程序上盡量消除人為誤差對結(jié)果的影響。此外，嚴格遵循標準操作流程（SOP）是確保檢測結(jié)果可靠性的關(guān)鍵。操作步驟的不規(guī)范可能導致結(jié)果的重復性差或誤差增大。目前，湖州申科已正式推出全自動化HCP ELISA檢測系統(tǒng)，可以完成從樣品制備、孵育、洗板至數(shù)據(jù)采集等一系列操作，結(jié)合實驗室信息管理系統(tǒng)（LIMS），可以實現(xiàn)“輸入即輸出”，減少流程誤差。

宿主細胞蛋白殘留檢測抗體覆蓋率評估實驗操作復雜，需要在建立實驗方法階段對關(guān)鍵步驟進行充分的驗證，以證明實驗方法的穩(wěn)健性。湖州申科開發(fā)的基于磁珠捕獲的IMBS方法（immunomagnetic beads separation），在開發(fā)過程中對關(guān)鍵步驟進行了充分驗證,相關(guān)結(jié)果經(jīng)過專業(yè)評審，驗證的內(nèi)容如下（部分）：①方法優(yōu)化：針對磁珠與抗體的偶聯(lián)比例、洗滌液體積、洗滌次數(shù)、洗脫次數(shù)等關(guān)鍵參數(shù)進行優(yōu)化驗證，以保證方法的穩(wěn)健性；②過程質(zhì)控：二維電泳存在實驗步驟多，時間跨度長，中間步驟難以控制等缺陷，因此在等電聚焦實驗部分設(shè)計了熒光標記多肽，可快速判斷等電聚焦效果。在SDS-PAGE電泳的兩側(cè)增加40 ng銀染質(zhì)控，用于銀染顯色的控制；③方法重復性：針對2D分析以及LC-MS分析進行重復性確認，其中2D分析方法重復性可達到80%以上，LC-MS分析方法可到90%以上；④上樣量優(yōu)化：針對2D分析以及LC-MS分析進行上樣量確認，消除上樣量差異對檢測結(jié)果帶來的影響；⑤假陽性：排除樣品與陰性抗體之間是否存在非特異性結(jié)合，確定IMBS實驗所設(shè)定的步驟、參數(shù)是否有假陽性結(jié)果存在。

目前通過Vero細胞培養(yǎng)的病毒有狂犬病病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等，種類繁多，工藝也各有千秋。湖州申科生物Vero細胞裂解型HCP殘留檢測試劑盒（一步酶聯(lián)免疫吸附法）針對工藝過程中Vero細胞裂解后產(chǎn)生的大量不同種類的HCPs，可定量檢測使用Vero細胞系生產(chǎn)并通過細胞裂解工藝收獲的生物制品中宿主細胞蛋白的殘留檢測，抗體與校準品可覆蓋近3000種蛋白。試劑盒操作簡便，提高實驗人員的時間利用率。試劑盒抗體覆蓋率為65.1%-85.1%（IMBS-2D）和76.9%(IMBS-MS，Unique Peptide≥2）。試劑盒嚴格遵循ISO13485質(zhì)量體系進行生產(chǎn)，并按照法規(guī)要求進行了性能驗證，各項性能滿足Vero宿主細胞蛋白檢測需求。