湖州申科生物CHO-K1 HCP 殘留檢測試劑盒（一步酶聯(lián)免疫吸附法）基于固相酶聯(lián)免疫吸附分析法，適用于基于CHO-K1細胞生產的生物制品中宿主殘留蛋白的定量檢測。該分析方法通過在預包被抗CHO-K1HCPs綿羊多抗的酶標板中加入校準品或待測樣品、HRP標記的抗CHO-K1HCPs綿羊多抗進行共孵育。洗滌后，加入TMB底物進行顯色反應，再使用終止液終止酶催化反應。利用酶標儀在450nm波長下測讀吸光度，其吸光度與校準品或待測樣品中的HCPs濃度成正相關，通過校準品擬合的劑量-反應曲線即可計算得出待測樣品中HCPs的濃度。本試劑盒對待測樣品無需進行特殊處理，只需通過合適的稀釋比例進行適用性驗證即可直接使用。本試劑盒操作步驟少，快速，檢測專一性強，性能穩(wěn)定可靠。

影響宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測結果的因素之一是方法選擇。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）和液相色譜-質譜聯(lián)用方法（LC-MS法）是目前HCP檢測的兩大常用方法。文獻統(tǒng)計顯示，目前對于總HCP定量，ELISA仍是主流方法；MS法作為對特定蛋白（例如，高風險蛋白）的鑒定和定量，已成為重要的互補手段。此外檢測過程中使用的試劑和耗材的質量直接影響檢測結果的準確性。低質量的試劑可能導致假陽性或假陰性結果。例如，抗體的特異性和親和力不足，可能導致ELISA檢測中的交叉反應；抗原代表性不強或是抗體覆蓋率低，可能會導致漏檢；稀釋液抗干擾能力弱，可能影響檢測準確性。案例研究表明，采用定制化方法替代原有商業(yè)化試劑盒后，抗原代表性和抗體覆蓋率明顯提高，HCP檢測值整體升高。

宿主細胞蛋白通常是與重要細胞功能相關的蛋白，如細胞增殖、基因轉錄、蛋白合成修飾、細胞存活、細胞凋亡等，在工藝過程中分泌或因細胞死亡或裂解而釋放。生產過程中，以下幾個因素會主要影響HCP的組成和豐度：①宿主細胞基因組調控及培養(yǎng)工藝：特定工藝下，潛在的HCP數(shù)量可能非常大，且非所有基因都表達，某些基因在不同的時間和條件下表達；如大腸桿菌約4300個基因，不同的工藝產物會經歷獨特的翻譯后修飾，增加了HCP的總數(shù)和生化復雜性。有研究表明，如大腸桿菌表達的蛋白，其不同蛋白之間存在數(shù)量差異，這些差異可能是對環(huán)境條件的適應性反應，但大多數(shù) (85-90%) 有潛在免疫原性的宿主細胞蛋白在不同的發(fā)酵過程中都會出現(xiàn)。②產物表達方式：宿主細胞與外源基因、載體和輔助成分組成的體系可以穩(wěn)定、瞬時和誘導表達；如大腸桿菌常見的表達形式有胞內表達、分泌表達、可溶性表達、不溶性的包涵體形式，以及融合和非融合表達。③純化步驟及產品本身的特性的影響：純化過程中大部分的HCP被去除(>99％)，殘留的HCP仍保留在產品中，可能與產品共結合，一起被純化。

畢赤酵母（Pichia pastoris）是第二代酵母表達系統(tǒng)中的代表性菌株，是美國FDA認定的GRAS（Generally Recognized As Safe）微生物，具有表達水平高，產物活性好，培養(yǎng)成本低，易擴大為工業(yè)化生產等特點。在生物制藥領域，酶制劑、胰島素、表皮生長因子、膠原蛋白等多種生物制劑已經通過畢赤酵母系統(tǒng)進行商業(yè)化生產。與其他產品雜質一樣，畢赤酵母宿主殘留蛋白（HCP）可能對生物制品的安全性和有效性產生不利影響，因此在生產監(jiān)測、產品放行等過程中需要對其進行定量研究并進行嚴格控制。SHENTEK^®畢赤酵母HCP殘留檢測試劑盒（一步酶聯(lián)免疫吸附法）是湖州申科生物自主研發(fā)、具有完全自主知識產權的、實現(xiàn)關鍵試劑全國產化的畢赤酵母HCP通用檢測試劑盒。本試劑盒適用于基于GS115、X33等在內的畢赤酵母菌株生產的生物制品中宿主殘留蛋白的定量檢測，操作步驟少、快速，檢測專一性強，性能穩(wěn)定可靠。

針對宿主細胞蛋白殘留檢測，工藝特異型檢測試劑盒（upstream-process）專為特定生產工藝設計，其關鍵在于使用產物的實際宿主細胞進行開發(fā)與驗證，模擬真實生產流程獲取廣譜HCP抗原，并要求抗血清具備高度覆蓋率以適應工藝變動，確保對特定生產流程殘留的高度準確監(jiān)控。平臺型檢測試劑盒（platform）則由生產商針對其特定表達宿主細胞和相近工藝自行開發(fā)，其優(yōu)勢在于可使用相同的參考標準品和試劑統(tǒng)一監(jiān)測在該宿主上生產的不同產品，適用于上游工藝足夠相似的產品線。通用型檢測試劑盒（commercial）則作為市售廣譜方案，適用于相似宿主細胞的常規(guī)檢測，但因其制備過程可能無法完全模擬目標產物的實際生產，必須嚴格評估多克隆抗體對特定產品HCP的覆蓋率，以保證檢測可靠性。三類試劑盒覆蓋從深度定制到通用篩查的不同需求。

按照美國藥典1132章節(jié)的要求，HCPs校準品需滿足代表性要求，即能覆蓋實際工藝產品生產中的HCPs。從HCP免疫檢測方法使用目的和預期風險管理要求考慮，滿足工藝開發(fā)和驗證，同時為了應對下游工藝中潛在的異常工藝失效，或工藝變更需求，建議采用上游發(fā)酵工藝末端，如澄清處理后工藝點的樣本作為HCPs的來源。在實際制備中，可采用空細胞或空載細胞在模擬實際工藝的預定條件進行采集，通過二維電泳或高分辨率質譜等蛋白質組學方法進行模擬工藝和實際工藝下HCPs的代表性表征分析。越靠近下游HCPs蛋白種類越少，也越接近DS中HCPs，但是其可能無法滿足工藝開發(fā)和驗證需求，也無法保證工藝的潛在風險，往往不推薦使用，或只作為上游工藝HCPs免疫檢測法的輔助使用。